Globalna harmonizacija određivanja hepcidina: identifikacija komutabilnog sekundarnog referentnog materijala

van der Vorm LN, Hendriks JCM, Laarakkers CM, Klaver SArmitage AE, Bamberg A et al. Toward worldwide hepcidin assay harmonization: identification of a commutable secondary reference material. Clin Chem 2016;62:993-1001. (originalni članak)

Hepcidin je peptidni hormon koji igra ključnu ulogu u metabolizmu željeza. Određivanje hepcidina je korisno u dijagnosticiranju i praćenju anemija. Širu upotrebu testa za određivanje koncentracije hepcidina u kliničkoj praksi ograničava nedovoljna standardizacija mjernih postupaka (MP). Cilj autora je harmonizacija koja se postiže kada su rezultati podudarni zbog sljedivosti prema sekundarnom referentnom materijalu (RM), tj. kalibratoru, kojem je vrijednost dodijeljena putem konsenzusa, poput prosječne vrijednosti metoda. Ovo istraživanje obuhvaća procjenu:

1) Analitičkih karakteristika korištenih mjernih postupaka (MP)

2) Trenutni i dostupni stupanj podudarnosti između MP

3) Prikladnost 8 različitih potencijalnih RM

4) Matematički simulirani uspjeh harmonizacije kod korištenja odabranog RM, izražen kao podudarnost i postavljen u kontekst ukupne dozvoljene pogreške (engl. total allowable error – TE).

U istraživanju su ispitane reproducibilnost, linearnost, komutabilnost i stabilnost. U istraživanju je sudjelovalo deset laboratorija. Koncentracija hepcidina je određivana različitim metodama (ELISA, LC-MS/MS, MALDI-TOF MS). Za istraživanje su korišteni uzorci heparinizirane plazme u širokom koncentracijskom rasponu. Nakon uzorkovanja plazma je pohranjena na -80°C do određivanja.

Kod statističke obrade podataka, izbačeni su rezultati koji su izrazito odstupali. U izračun CV su uključene koncentracije hepcidina koje su se mogle izmjeriti svim metodama. Analitičke karakteristike MP su izračunate na sljedeći način: reproducibilnost (CV) je izračunata na osnovi logaritamske transformacije rezultata mjerenja u triplikatu za 32 uzorka; korelacije su izračunate kao Spearmanov rank koeficijent između svake kombinacije 2 MP. Linearnost je procijenjena iz dijagrama očekivanih rezultata nasuprot rezultatima mješavina u različitim omjerima, i izražena kao sjecište a, nagib b i Pearsonov korelacijski koeficijent s pripadajućim CV (%).

Koncentracije hepcidina izmjerene u 64 uzorka su se razlikovale između MP. Reproducibilnost mjerenja se kretala od 2,9% za LC-MS/MS do 8,7% za ELISA. Korelacija MP je bila zadovoljavajuća i kretala se od 0,96-1,00, što ukazuje na činjenicu da je glavni uzrok nepodudarnosti MP kalibracija, a ne heterogenost hepcidina. Usporedivost analitičkih karakteristika (reproducibilnost, linearnost i međusobna korelacija) 10 MP omogućava harmonizaciju njihovih rezultata. Podudarnost između ispitivanih MP, izražena kao CV (%) između metoda je bila 28,6%. Udio nepreciznosti i nelinearnosti je bio relativno malen (10,8%, odnosno 6,7%). MP su se razlikovali u načinu mjerenja manjih izoformi hepcidina (hepcidin -20, -22 i -24) koje su uključene u neka imunokemijska mjerenja. Kod uzoraka s visokim koncentracijama hepcidina, moguća je prisutnost manjih izoformi hepcidina. Prijašnja istraživanja su pokazala da dulje stajanje (>1 dan) uzorka na sobnoj temperaturi dovodi do razgradnje hepcidina -25 na manje izoforme. Kod ovog istraživanja su uzorci bili na sobnoj temperaturi maksimalno 8 sati, tako da autori pretpostavljaju da heterogenost proizlazi iz činjenice da je nejasno da li MP mjere slobodni hepcidin ili hepcidin vezan na α2-makroglobulin. Taj nedostatak se može ukloniti samo modifikacijom testa, a ne harmonizacijom. Autori su procijenili da je maksimalna podudarnost između MP koja se može postići nakon optimizacije svih čimbenika na koje je moguće utjecati 8%.

Ispitivanje komutabilnosti pokazalo je da su potencijalni RM bazirani na nativnom uzorku plazme bolji od onih koji su bazirani na plazmi kojoj je dodan sintetski hepcidin. Uzrok tome bi mogao biti učinak matriksa, prisutnost drugog ne-nativnog analita i neodgovarajuća specifičnost nekih MP za sintetski hepcidin-25. Dobiveni rezultati ovog istraživanja pokazuju da dodavanje kriolioprotektanta (CLP) poboljšava komutabilnost, posebno kod nativnih RM. Pretpostavka je da CLP ima pozitivan učinak na zaštitu nativnog hepcidina od denaturiranja za vrijeme zamrzavanja/otapanja i liofilizacije. Nativni liofilizirani uzorak plazme s CLP je bio komutabilan za svih 10 ispitivanih MP i zadovoljio je kriterije komutabilnosti prema protokolu CLSI C53-A.

Ispitivanje stabilnosti sekundarnog RM pokazalo je da nije bilo značajnog pada koncentracije hepcidina u ispitivanim RM, osim za nativni liofilizirani RM bez CLP.

Pošto klinički prihvatljiva granica za CV između metoda nije prihvatljiva, autori su uzeli općeniti kriterij od ≤10%. Simulirana harmonizacija je potvrdila da kalibracija s nativnom liofiliziranom plazmom s CLP-om ima najbolju podudarnost između MP, sa CV od 7,7% za 97% uzoraka. Izračun TE zasnovan na CVI i CVG bio je 23,3% (optimalni), 46,5% (poželjni) i 69,8% (minimalni). Simulirani rezultati nakon harmonizacije s nativnim liofiliziranim kalibratorom s CLP su bili gotovo svi unutar granica za minimalni TE. Osim 2 imunokemijska rezultata, svi su bili unutar poželjne TE, a veći dio unutar granica optimalnog TE.

Zaključci istraživanja su sljedeći:

1) moguće je provesti harmonizaciju MP

2) komutabilni, stabilni RM je nativna, liofilizirana plazma s CLP-om

3) kalibracijom MP s odabranim RM postiže se smanjenje CV između MP od 28,6% na 7,7%.

Harmonizacija i standardizacija mjerenja hepcidina omogućit će definiranje referentnih intervala i granica odluke, primjenu smjernica i usporedbu rezultata raznih istraživanja.

Pripremila: Lora Dukić, KBC Sestre milosrdnice, Zagreb